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生物样本库标本处理流程
    来源:本网站 发布日期:2016-07-13 点击量:4749

(一)标本采集标准操作规程

1.采取部位

(1)静脉采血  应用最多的采血方式。常用的静脉为肘前静脉、腕背静脉,小儿和新生儿有时用颈静脉和前囟静脉。

(2)动脉采血  主要用于血气分析时。常用的动脉为股动脉、肱动脉、桡动脉和脐动脉。

(3)毛细血管采血  适用于仅需微量血液的试验或婴幼儿。常用部位为耳垂、指端,小儿有时为大趾和足跟。采血针刺入皮肤深度应为2mm (<2.5mm.),采血局部应无炎症、水肿等。

(4)标本类型:科学研究保存血液标木分为血清、血浆、外周血单个核细胞和全血4种。建议临床科室采集抗凝及非抗凝全血各5ml,由标本库负责标本分类、分装、保存。

2.血液标本的处理

血液标本采集后应尽快分离。一般应于采血后8h内分离出血清或血浆。

 

(二)科研标本处理标准流程

1、分离血浆、血清SOP

(1)按规程接收标本。

(2)核对标本信息。

(3)全血2000转离心10min。

(4)将血浆分装于冻存管中,每管500u1。

(5)放置于-80℃冰箱中入库。

 

2. 分离PBMC SOP

(1)原理:

外周血单个核细胞(peripheral   blood   mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞,是免疫试验中最常用的细胞群。PBMC的密度与血液中的其他成分不同。血小板的密度为1.030~1.035,淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075~1.092,粒细胞的为1.092,红细胞为1.093。因此,利用一种密度介于1.075~1.092之间、近似等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心,可使不同类别的血细胞按其相应密度分布,从而被分离。

(2)目的:

将分离到的PBMC用于培养,获得所需要的细胞,用于其它后续试验。

(3)方法:

(a)将肝素锂抗凝的全血编号,配平,2000rpm/min离心10min。将血浆取出,于-80℃冻存。剩下的血细胞加PBS至l0ml,混匀。

(b)取2支离心管,每管加4m1淋巴细胞分离液,将上述混好的全血缓慢加到淋巴细胞分离液的上层,使两者形成一个清晰的界面。

(c)配平,2500rpm/min离心20min后得到4个细胞层,从上到下依次为稀释的血浆、PBMC、粒细胞、红细胞。

(d)取第二层白膜层至离心管内,补加PBS至l0ml,配平,1500rpm/min离心10min。

(e)弃上清,加PBS至10ml混合均匀,并进行细胞计数。

(f)1500rpm/min离心5min,弃上清,轻轻弹散细胞团,按1:1加A、B液,混匀,以5×106~1×107/管迅速放置于冻存盒中。

(g)将冻存盒放入-80℃冰箱。

(h)次日将冻存细胞移入液氮中。

(4)注意事项:

(a) 注意整个过程无菌操作。

(b) 离心时注意配平,防止不稳导致细胞离心效果不好。

(c)将全血往淋巴细胞分离液上层加时注意速度要缓慢,形成一个清晰的液面层,防止混合,影响分离效果。

(d)A、 B液混合为冻存液,用于细胞的冻存。

(e)A液为牛血清; B液为牛血清与DMSO的混合,比例为4:1。

(f)细胞在冻存盒内不要放太长时间,影响细胞的存活寿命,尽快移植到液氮罐内保存。

 

3. 基因组DNA提取SOP

按照血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)说明书进行实验操作:

(1)吸取200μl全血,加入4μ RNase A(100mg/ml)溶液,振荡15秒,室温放置5分钟;

(2)加入20μl蛋白酶K,充分混匀;

(3)加入200μl的缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10min,期间颠倒混匀数次,溶液应变清亮;

(4)加入200μl无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能出现絮状沉淀;

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中),12,000r/min(~13,400g)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中;

(6)向吸附柱CB3加入500μ缓冲液GD,12,000r/min(~13,400g)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中

(7)向吸附柱CB3加入600μ漂洗液PW,12,000r/min(~13,400g)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中

(8)重复操作步骤(7);

(9)12,000r/min(~13,400g)离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;

(10)将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50μl~200μl洗脱缓冲液TB,室温放置2-5分钟,12,000r/min(~13,400g)离心2分钟,将溶液收集到离心管中,-20℃保存备用。